ORIGIN AND FATE OF ARSENOBETAINE IN MUSHROOMS

Abstract

Arsenic (As) occurs ubiquitously in the environment in many different forms (referred to as species) that differ in their physical, chemical and biological properties as well as toxicities. Only one of these species, arsenobetaine (AB), is considered to be non-toxic. AB has been identified in high proportions and concentrations in many marine organisms, but it is found to a much lesser extent in the terrestrial environment. The fruiting bodies of some terrestrial fungi (i.e., mushrooms) are one of the few terrestrial organisms that contain AB in high proportions, thereby offering a unique opportunity to investigate the formation of AB in a non-marine system. This thesis examines the total arsenic concentration and arsenic species present in mushrooms, as well as potential formation pathways for AB. To investigate the impact of the growth substrate and the role of microbial communities on arsenic speciation in mushrooms, the arsenic speciation was compared in log- and soil-growing mushrooms. The total arsenic concentrations, measured with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), and arsenic speciation, measured with high performance liquid chromatography (HPLC) – ICP-MS, were determined for 10 soil-growing and nine log-growing mushrooms collected from an area with naturally elevated arsenic concentrations. The predominant arsenic species were similar among phylogenetic groups and morphologies, and corresponded to previous trends observed in these categories. AB was detected in several of the log-growing species, indicating that the growth substrate and/or microbial community are not solely responsible for the presence/absence of AB. Measurements using X-ray absorption spectroscopy (XAS), specifically X-ray absorption near edge structure (XANES), of arsenic speciation in mycelia of mushrooms containing AB, revealed no AB in mycelia either from logs or the ground, verifying the specificity of AB to the reproductive (fruiting body) stage of the mushroom. The role of AB in mushrooms was hypothesized to be similar to that of glycine betaine, a known osmolyte. Betaine (measured with HPLC-mass spectrometry) and previously measured AB concentrations were compared for 46 mushrooms. Low betaine concentrations were typically accompanied by an absence of AB and AB was generally detected in mushrooms with a high betaine concentration. This suggests a similar, but not competitive role for these two compounds, indicating that mushrooms capable of utilizing betaine may also be able to use AB. Currently, there has been no research conducted on the possible speciation changes in mushrooms as a result of common preparation methods for consumption, that is, cooking. As mushrooms are one of the only commonly consumed terrestrial organisms that contain high proportions AB, it is crucial to identify if speciation changes to more toxic species are taking place. A total of 12 edible mushrooms were subjected to a variety of different high temperature preparation methods (frying, baking, and barbequing). For most mushrooms, cooking, specifically frying, resulted in a decrease in the overall total arsenic concentration. However, this was accompanied by changes in the proportions of the arsenic species. For some mushrooms, the thermal treatments resulted in the methylation of some arsenic species to form trimethylarsine oxide (TMAO). Degradation of AB to the more toxic tetramethylarsonium ion (TETRA) was also observed. Synthetic experiments were conducted to investigate the feasibility of two different hypothesized AB formation pathways in the terrestrial environment. The first synthetic experiment confirmed that TMAO could be transformed to AB using glutathione (GSH) and iodoacetic acid (IoAA). Iodoacetic acid was identified in two of three soils examined in the present study, verifying that all of these reactants can be found in soils and making this a very plausible formation pathway for AB in the terrestrial environment. In the second synthetic experiment dimethylarsinous acid (DMA(III)) was investigated as a potential precursor to AB, but no AB was identified in the final reaction products. However, this may have been due to experimental conditions and DMA(III) should continue to be investigated as a potential precursor to AB. The findings of this thesis have increased the knowledge about factors influencing the origin, role, and fate of AB in mushrooms and a synthetic pathway for the formation of AB under naturally occurring environmental conditions has been identified. However, future study is warranted to determine the exact formation pathway for this compound in mushrooms.

Arsenic (As) est omniprésent dans l'environnement et existe sous différentes formes (nommées espèces) qui diffèrent par leurs propriétés physiques, chimiques et biologiques ainsi que par leurs toxicités. Une seule de ces espèces, arsénobetaïne (AB), est considérée comme non toxique. L’AB a été identifiée en proportion et concentration élevées dans de nombreux organismes marins, mais est peu présent dans l'environnement terrestre. Les organes de fructification de certains champignons terrestres (i.e. champignons) sont l'un des rares organismes terrestres qui contient de l’AB en proportion élevée; offrant ainsi une occasion unique d'étudier leur formation dans un système non-marin. Cette thèse examine la concentration total et les diverses espèces d’arsenic présent dans les champignons, ainsi que les voies de formation potentielle de l’AB. Pour étudier l'impact du substrat de croissance et le rôle des communautés microbiennes sur la spéciation de l'arsenic dans les champignons, ceux-ci ont été cultivés en sol et sur bûche. La concentration d'arsenic total, mesurée par spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS), ainsi que la spéciation, mesurée par la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) – ICP-MS, ont été déterminée pour 10 sols et 9 bûches provenant de zone historiquement contaminée par l'arsenic. Les espèces d’arsenic prédominant étaient similaires parmi les groupes phylogénétiques et morphologies, et correspondent aux tendances antérieures observées dans ces catégories. L’AB a été détectée dans plusieurs espèces de champignon poussant sur bûche, ce qui indique que le substrat de croissance et/ou de les communautés microbiennes ne sont pas les seuls responsable de la présence absence d'AB. Les mesures par spectroscopie d'absorption des rayons X (XAS), plus précisément spectroscopie de structure près du front d'absorption des rayons X (XANES), n'a révélé aucune AB dans les mycéliums du sol ou des bûches, montrant la spécificité de l’AB pour l’organe de fructification lors du stade reproduction. L'hypothèse a été émis que le rôle de l’AB dans les champignons est semblable à celle de la glycine bétaïne, un osmolyte connu. La bétaïne (mesurés par HPLC et spectrométrie de masse) et les concentrations AB précédemment mesurées ont été comparées pour 46 champignons. Les faibles concentrations de bétaïne sont généralement accompagnées d'une absence d’AB et l’AB a généralement été détectée dans les champignons avec une concentration élevé de bétaïne. Ceci suggère un rôle similaire, mais pas compétitif pour ces deux composés, ce qui indique que les champignons capables d'utiliser bétaïne peuvent également être en mesure d'utiliser AB. Présentement, aucune recherche n’a été menée sur les possibles changements de spéciation de l’arsenic dans les champignons lors de leur préparation pour la consommation humaine. Puisque les champignons sont l'un des seuls organismes terrestres couramment consommés contenant des proportions élevées d’AB, il est crucial d'identifier si la spéciation de l’arsenic change pour des espèces plus toxiques. Un total de 12 champignons comestibles ont été soumis à une variété de différentes cuisons à haute température (friture, cuisson, et barbecue). Pour la plupart des champignons le mode de cuisson, particulièrement la friture, a entraîné une diminution de la concentration de l'arsenic total. Cependant, ceci était accompagné par des changements dans les proportions des espèces d'arsenic. Pour certains champignons, les traitements thermiques ont donné lieu à la méthylation de certaines espèces d'arsenic pour former du triméthylarsine oxyde (TMAO). La dégradation de l'AB en un ion plus toxique, le tétraméthylammonium (TETRA), a également été observée. Des expériences de synthèse ont été menées afin étudier la faisabilité des deux hypothétiques voies de formation de l’AB dans l'environnement terrestre. La première expérience a confirmé que le TMAO synthétique peut être transformé en AB en utilisant le glutathion (GSH) et l'acide iodoacétique (IoAA). L'acide iodoacétique a été identifiée dans deux des trois sols examinés lors de cette étude, montrant que ce réactif peut être présent dans les sols, rendant cette voie de formation de l’AB très plausible dans l'environnement terrestre. Dans la seconde expérience, l’acide diméthylarsenic (DMA(III)) a été étudiée comme précurseur potentiel de l’AB, mais aucune AB n’a été identifié dans les produits finaux de la réaction. Toutefois, cela peut être dû aux conditions expérimentales et DMA (III) devrait continuer à être étudiée comme un précurseur potentiel de l’AB. Les résultats de cette thèse ont permis d’accroitre les connaissances sur les facteurs qui influencent l'origine, le rôle et le destin de l’AB dans les champignons, ainsi que l’identification d’une voie de synthèse en conditions naturels. Cependant, de futures études sont nécessaires afin de déterminer les voies exactes de formation dans les champignons.