Exogenous iron causes precipitation that precedes iron mediated cell death in yeast

Abstract

The essential micronutrient iron is associated with two forms of human pathophysiologies; namely anemia because of inadequate iron and toxicity because of excess iron. Its ability to gain and lose electrons as it interconverts between ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+) forms makes it indispensable as an electron carrier in many cellular processes. This same property makes iron toxic to the cell given that free electrons can react with cellular constituents to produce highly toxic Reactive Oxygen Species (ROS). The prevailing model of iron toxicity is that excess iron enters the cell and induces cell death by increasing the levels of ROS. The Greenwood lab uses the yeast Saccharomyces cerevisiae as a simplified model to study cellular responses to excess iron. Previous results show that excess extracellular iron does not enter cells and is associated with the formation of an insoluble precipitate with the yeast growth media. This research is focused on the hypothesis that exogenous iron causes cell death by precipitating with an essential component of yeast media, leading to nutrient depletion. Using spot growth assays, we show that iron is a dose-dependent inhibitor of yeast growth. No growth inhibition was observed at concentrations below 5mM iron, half-maximal growth inhibition was observed with 7mM, while complete growth inhibition occurred at a concentration of 8mM FeCl3. In an analogous fashion, the iron mediated accumulation of precipitation in yeast growth media was also found to increase in a dose dependent manner. Pronounced precipitation was observed at concentrations of iron as low as 0.4mM, with half-maximal precipitation occurring at 4mM, while maximum precipitation required 20mM FeCl3. These observations demonstrate that iron mediated accumulation of a precipitate in YNB yeast growth media is an event that precedes the negative effects of iron on yeast cell growth. This suggests that the formation and accumulation of a precipitate serves to mediate the toxic effects of excess iron. Analysis of the chemical composition of yeast growth media suggests that the phosphate anion (PO43-) is likely responsible for the observed precipitate. This is based on two separate considerations: first, PO43- is present at sufficiently high concentrations to account for the formation of 4.5mg of precipitate from 1 ml of YNB yeast media, and second, the PO43- anion is highly insoluble with Fe3+, with a Ksp value for iron phosphate (FePO4) of 9.91x10-16 (25ºC). In conclusion, the results showing that iron mediated precipitation precedes iron mediated growth inhibition supports the hypothesis that iron toxicity is due to the depletion of phosphate, an essential micronutrient. Support for this comes from a previous study showing that depletion of phosphorus leads to the induction of apoptosis like cell death.

Le fer, micronutriment essentiel, est associé à deux formes de physiopathologies humaines ; l'anémie en raison d'une carence en fer et la toxicité en raison d'un excès de fer. Sa capacité à gagner et à perdre des électrons lors de l'interconversion entre les formes ferreuse (Fe2+) et ferrique (Fe3+) le rend indispensable en tant que porteur d'électrons dans de nombreux processus cellulaires. Cette même propriété rend le fer toxique pour la cellule étant donné que les électrons libres peuvent réagir avec les constituants cellulaires pour produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS) hautement toxiques. Le modèle dominant de toxicité ferreuse est que l'excès de fer pénètre dans la cellule et induit la mort cellulaire en augmentant les niveaux de ROS. Nous utilisons la levure Saccharomyces cerevisiae comme modèle simplifié pour étudier les réponses cellulaires à l'excès de fer. Nos résultats précédents montrent que l'excès de fer extracellulaire ne pénètre pas dans les cellules et est associé à la formation d'un précipité insoluble avec les milieux de croissance de levure. Mes recherches portent sur l'hypothèse selon laquelle le fer exogène provoque la mort cellulaire en précipitant avec un composant essentiel des milieux de levure, entraînant un épuisement de nutriments. En utilisant des tests de croissance, nous montrons que le fer est un inhibiteur dose-dépendant de la croissance des levures. Aucune inhibition de la croissance n'a été observée à des concentrations inférieures à 5 mM de fer, une inhibition de croissance semi-maximale a été observée avec 7 mM, tandis qu'une inhibition de croissance complète s'est produite à une concentration de 8 mM de FeCl3. De manière analogue, l'accumulation de précipitation médiée par le fer dans les milieux de croissance de levure s'est également avérée a augmenter de manière dose-dépendante. Des précipitations prononcées ont été observées à des concentrations de fer aussi faibles que 0,4 mM, avec des précipitations semi-maximales se produisant à 4 mM, tandis que les précipitations maximales nécessitaient 20 mM de FeCl3. Ces observations démontrent que l'accumulation médiée par le fer d'un précipité dans les milieux de croissance de levure YNB est un événement qui précède les effets négatifs du fer sur la croissance des cellules de levure. Cela suggère que la formation et l'accumulation d'un précipité servent à médier les effets toxiques de l'excès de fer. L'analyse de la composition chimique du milieu de croissance de levure suggère que l'anion phosphate (PO4 3-) est probablement responsable du précipité observé. Ceci est basé sur deux considérations distinctes : premièrement, PO43- est présent à des concentrations suffisamment élevées pour expliquer la formation de 4,5 mg de précipité à partir de 1 ml de milieu de levure YNB, et deuxièmement, l'anion PO43- est hautement insoluble avec Fe3+, avec une valeur Ksp pour le phosphate de fer (FePO4) de 9,91x10-16 (25ºC). En conclusion, nos résultats montrant que la précipitation médiée par le fer précède l'inhibition de la croissance médiée par le fer soutient notre hypothèse selon laquelle la toxicité ferreuse est due à l'épuisement du phosphate, un micronutriment essentiel. Cette est aussi supporté des études précédente montrant que l'épuisement du phosphore conduit à l'induction de la mort cellulaire apoptototique.