Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/11264/541
Title: Elucidating a Biosynthetic Pathway for Arsenobetaine in Higher Terrestrial Fungi
Authors: Nearing, Michelle M
Royal Military College of Canada / Collège militaire royal du Canada
Reimer, Kenneth J
Koch, Iris
Keywords: arsenic
arsenobetaine
fungus
biotrasformation
mycelium
fruiting body
microbial community
biosynthetic pathway
Issue Date: 2-Mar-2015
Abstract: The toxicity of arsenic is greatly dependent on its chemical form and only one arsenic compound is considered to be non-toxic, arsenobetaine (AB). The formation pathway for AB is still unknown despite being found in high concentrations and proportions in many marine organisms. AB is found in fewer organisms and at lower concentrations and proportions in the terrestrial environment with the exception of the fruiting bodies (FBs), or mushrooms, of terrestrial fungi. The present study interrogated AB formation pathways in the complete fungal organism (fungus and associated microbes) through a combination of fruiting body and substrate analysis, and culture experiments. The analytical methods used were reviewed and selected to include complementary high performance liquid chromatography – inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP- MS) and X-ray absorption spectroscopy (XAS), specifically x-ray absorption near edge structure (XANES) and XAS 2-dimensional imaging. A comprehensive survey of arsenic compounds in the mushrooms of 46 different fungus species over a diverse range of phylogenetic groups were collected from Canadian grocery stores and background (sites with lower arsenic concentrations) and arsenic-contaminated areas. The major arsenic compounds in mushrooms were found to be similar among phylogenetic groups, and AB was generally absent in log-growing mushrooms, suggesting the microbial community may influence arsenic speciation in mushrooms. The high proportion of AB in mushrooms with puffball or gilled morphologies may suggest that AB acts as an osmolyte in certain mushrooms to help maintain fruiting body structure. The mycelia of three different fungi species (targeting those containing AB, including Agaricus bisporus) were cultured axenically and exposed to AB, arsenate (As(V)) and dimethylarsinoyl acetic acid (DMAA, a potential AB precursor) for 60 days. The mycelia of all fungi species accumulated all arsenic compounds with two species (those whose fruiting bodies contain mostly AB) accumulating significantly more AB than other compounds, but few biotransformations were observed. Thus AB biosynthesis by fungus mycelium is unlikely. To investigate the involvement of reproductive life stage of Agaricus species (an AB-containing fungus) in AB formation growth substrate and fungi were collected and analyzed during the commercial growth of A. bisporus. AB was found to be the major arsenic compound in the fungus at the earliest growth stage of fruiting (the primordium). AB was revealed by two-dimensional imaging to be present only in fungal tissue and not in embedded substrate of an A. bisporus primordium grown on As(V) treated substrate, and in a mature A. campestris fruiting body stalk from arsenic contaminated mine tailings. These findings indicate AB formation is likely associated with the reproductive life stage of the fungus. To interrogate the contribution to AB formation of the microbial communities associated with mushrooms, 16s pyrosequencing techniques were used to reveal that phyla diversity in the growth material for the commercial cultivation of A. bisporus increased at the time of FB initiation, coinciding with the appearance of AB. Microbial communities from similar locations were found to have similar microbial structures, but were different between log materials and soil substrates. Ten bacteria species associated with FB initiation and AB containing FBs did not transform As(V), dimethylarsinic acid (DMA) and DMAA under axenic culture. Similarly a consortia of microbes isolated from FB-associated soil did not produce AB. Overall, AB formation appears to be associated with the reproductive life stage of the fungus and likely involves a combination of organisms, perhaps those symbiotically associated with each other.
Le niveau de toxicité de l’arsenic dépend largement de sa forme chimique, et un seul composé d’arsenic, l’arsénobétaïne (AB), est considéré non-toxique. Bien que l’AB existe en concentrations et proportions élevées dans plusieurs organismes marins, son mécanisme de synthèse demeure inconnu. En milieu terrestre, l’AB se trouve en plus faibles concentrations et proportions, à l’exception des fructifications, ou champignons, d’organismes fongiques terrestres. Le présent ouvrage a examiné les voies de synthèse de l’AB dans l’organisme fongique complet (qui inclut à la fois le champignon et les microbes qui y sont associés) par le biais d’analyses des fructifications (les fruits du champignon) et des substrats, ainsi que par des expériences de cultures champignonnières. Diverses méthodes d’analyse ont été évaluées et les méthodes complémentaires suivantes ont été retenues : chromatographie liquide à haute performance – spectrométrie de masse avec plasma à couplage inductif (CLHP-SM-PCI), et spectroscopie par absorption de rayons-X (SAX), plus particulièrement la spectroscopie de structure près du front d’absorption de rayons-X (SSPAX), et l’imagerie en deux dimensions de la SAX. Un relevé exhaustif des composés d’arsenic se trouvant dans les champignons de 46 espèces d’organismes fongiques différents couvrant un vaste éventail des groupes phylogénétiques a été complété à partir de spécimens provenant de supermarchés canadiens, de sites de référence (où les concentrations d’arsenic sont faibles), et de régions contaminées à l’arsenic. Les principaux composés d’arsenic dans les champignons sont similaires parmi les groupes phylogénétiques, et l’AB est généralement absent chez les champignons qui poussent sur des troncs d’arbres, ce qui suggère une influence de la communauté microbienne dans la spéciation de l’arsenic par le champignon. Les grandes proportions d’AB dans les champignons de morphologies charnue ou lamellée peuvent suggérer que l’AB joue un rôle osmotique dans le maintien structurel de la fructification. Les mycéliums de trois différentes espèces d’organismes fongiques (choisies parmi celles qui contiennent de l’AB, dont l’Agaricus bisporus) ont été cultivés en milieu axénique et exposé à l’AB, à l’arséniate (As(V)) et à l’acide acétique de diméthylarsinoyle (AADM, un précurseur potentiel de l’AB) durant une période de 60 jours. Ces composés d’arsenic ont été accumulés dans le mycélium de chaque espèce de champignon, et deux de ces espèces (celles dont les fructifications contenaient principalement de l’AB) ont accumulé une plus grande quantité d’AB que les autres composés (de façon significative), mais comportant peu de biotransformations. Il est donc peu probable que le mycélium fongique procède à la biosynthèse de l’AB. Pour enquêter sur la synthèse de l’AB durant le cycle de reproduction des espèces Agaricus (champignons contenant de l’AB), des échantillons de substrat et de champignons ont été prélevés et analysés au cours de la croissance de A. bisporus en production commerciale. Le composé d’arsenic principal s’est avéré être l’AB dans le champignon au tout début de son cycle de fructification (étape primordiale). Une analyse par imagerie en deux dimensions a révélé que l’AB ne se trouve que dans la matière fruitière et non dans les composantes du substrat d’un thalle primordial de A. bisporus dont le substrat a été imprégné d’As(V), ainsi que dans la tige d’un champignon A. campestris ayant complété sa croissance dans des résidus miniers contaminés à l’arsenic. Ces résultats indiquent que la formation de l’AB est probablement associée au cycle de reproduction des champignons. Des techniques de pyroséquençage 16s ont été employées fin d’élucider la contribution de l’AB à la formation des communautés microbiennes associées aux champignons. Celles-ci ont révélé que, dans le substrat de croissance utilisé en culture commerciale du A. bisporus, la diversité phylétique est plus importante à l’amorce de la fructification, ce qui coïncide avec l’apparition de l’AB. Les communautés microbiennes de milieux similaires se ressemblent, et sont différentes des communautés associées aux troncs d’arbres et aux substrats de terre. Des dix espèces bactériennes associées à l’initiation de la fructification et à des organismes fongiques contenant de l’AB, aucune n’a transformé l’As(V), l’acide diméthylarsinique (ADMA), ou l’AADM en culture axénique. De même manière, un consortium microbien isolé des sols associés à la fructification n’a pas produit d’AB. En fin de compte, il semble que la synthèse d’AB soit liée au cycle de reproduction champignons et implique probablement une combinaison d’organismes, dont certains fonctionnent en association symbiotique.
URI: https://hdl.handle.net/11264/541
Appears in Collections:Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Final Thesis for Upload MNearing.pdfFinal Thesis4.68 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in eSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.